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CYTOMETRIE DEFLUX |
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CYTOMETRIE DEFLUX |
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Technique
La cytométrie de flux permet de déterminer le contenu cellulaire en DNA. Une suspension monocellulaire est traitée par une colorant fluorescent qui reflète le contenu en DNA. Les cellules sont passées au travers d'un rayon laser qui excite le colorant. La fluorescence émise est analysée par une cellule photoélectrique.
Plusieurs colorants différents sont utilisés. L'acridine orange colore en vert fluorescent le DNA double brin, et en rouge fluorescent le RNA. Elle discrimine les cellules en G1 par rapport aux cellules non proliférantes. L'utilisation d'anticorps fluorescents ou de sondes fluorescentes permet d'étudier plus à fond la métabolisme cellulaire. Des techniques ont été mises au point pour dissoudre la paraffine des coupes histologiques, et permettre des corrélations entre les constatations histologiques et les facteurs de prolifération cellulaire.
L'utilisation de précurseurs fluorescents des bases nucléaires (5-bromo-deoxyuridine ou BrdUrd, et 5-iodo-deoxyuridine ou IdUrd ) qui s'incorporent dans le DNA permet d'estimer le taux de marquage ou LI.
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Description
sommaire d’un appareillage de cytométrie de flux. Les cellules sont dispersées dans du sérum physiologique et passent à travers un faisceau de lumière laser. La diminution de l’intensité du faisceau direct permet de mesure la masse cellulaire ou la masse de DNA. Les cellules qui émettent de la fluorescence sont reconnues par une cellule photoélectrique particulière. Enfin, on peut éventuellement séparer les cellules selon leur charge électrique : séparateur de cellules. |
Expression des résultats
La cytométrie de flux étudie la distribution des cellules dans le cycle cellulaire : les cellules contenant 2N chromosomes de DNA sont les cellules en G1 et les cellules non proliférantes. Les cellules contenant 4N chromosomes de DNA sont en G2 ou en mitose. Entre ces deux valeurs, on trouve les cellules en phase S. |
Schéma d’une
population de cellules normales. Les érythrocytes de poulet sont nucléés et servent comme repère. Le pic G1 correspond aux cellules à contenu de DNA 2N. Les cellules en G2 et M ont 4N chromosomes. Les cellules en phase S sont intermédiaires. |
On étudie ainsi la distribution des cellules dans le cycle cellulaire, la fraction de croissance, les propriétés cinétiques des populations cellulaires, le temps de la phase S ou Ts, le nombre de marquage des mitoses ou LI, et le temps potentiel de doublement ou Tpot.
Si on prélève une biopsie peu de temps après l'injection intraveineuse de BrdUrd, on obtient le temps Ts et le temps Tpot , utilisés pour l'étude du fractionnement en radiothérapie.
D'autres antigènes de prolifération sont reconnus par des anticorps fluorescents spécifiques ou par une double marquage. On peut ainsi mieux connaître les populations très proliférantes, c'est-à-dire les plus dangereuses
Notion de ploïdie
On appelle diploïdes des cellules contenant du DNA en 2N, (avec un petit contingent en 4N consistant dans les cellules en phase S et M). |
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Les cellules cancéreuses contiennent en général des éléments aneuploïdes (c'est-à-dire avec un contingent de cellules ayant plus de 2N chromosomes en G1) ou multiploïdes (c'est-à-dire avec un contingent contenant plusieurs clones de cellules ayant une quantité de DNA irrégulière, non multiple de 2N).Schéma de cytométrie de flux de cellules cancéreuses. A gauche, il existe une multiploïdie avec la présence de plusieurs pics G1 et de plusieurs pics G2 et M. A droite, on observe une aneuploïdie, c’est à dire un pic de cellules contenant un nombre irrégulier de chromosomes, aboutissant à une augmentation irrégulière de la masse de DNA ; le pic G2 – M est très élargi.
En règle générale, plus une tumeur est aneuploïde, plus elle évolue vite, et le degré d'aneuploïdie ou de multiploïdie est un facteur de mauvais pronostic.
