La présence de folates sous forme réduite, ou tétrafolates (FH₄), est indispensable à l’action de transfert d’un radical méthyle par la thymidilate synthétase, et aboutit à la formation de difolates (FH₂). Pour régénérer les tétrafolates (FH₄) à partir des difolates (FH₂), la dihydrofolate réductase est indispensable. Le MTX est un inhibiteur compétitif, et prévient la réduction des difolates.

Représentation schématique de l’action du méthotréxate sur le métabolisme cellulaire. Il existe une compétition inhibitrice vis à vis de la réductase des di-hydrofolates (FH2) nécessaire pour la régénération des tétra-hydrofolates (FH4). Ces folates réduits sont nécessaires pour la synthèse des purines et pour la conversion du monophosphate de deoxyuridine ent monophosphate de thymidine pour la synthèse du DNA.

La cellule est privée d’un métabolite indispensable à la synthèse de DNA, s’accroît en taille (formant des mégaloblastes) et meurt.